来源：生命科学前沿
该文章于2025年3月3日在Emerging Microbes & Infections上发表，IF为8.4。全文链接（DOI）：10.1080/22221751.2025.2469662
摘要
非洲猪瘟 （ASF） 是由非洲猪瘟病毒 （ASFV） 引起的一种高度传染性的严重传染病。该疾病严重威胁着全球养猪业的可持续发展。不幸的是，迄今为止，除越南外，没有安全有效的疫苗在市场上销售。抗氧化应激是抗病毒策略的关键因素。在这项研究中，我们表明 ASFV 感染在体外和体内提高了活性氧 （ROS） 的水平并抑制了核因子红细胞 2 相关因子 2 （Nrf2） 信号通路。此外，过表达 Nrf2 可以显着抑制 ASFV 复制。通过针对 ASFV 的天然小分子的高通量筛选，我们确定了白藜芦醇 （RES），一种 Nrf2 激活剂，是一种能够诱导细胞抗病毒反应并有效抑制原代猪肺泡巨噬细胞 （PAM） 中 ASFV 复制的化合物。值得注意的是，非靶向代谢组学分析显示，谷胱甘肽是与 RES 对 ASFV 的抗病毒活性相关的主要差异代谢物。从机制上讲，RES 通过激活 Nrf2 信号通路诱导还原型谷胱甘肽 （GSH） 的产生，从而发挥其抗病毒作用并减轻 ASFV 感染引起的 ROS 水平升高。总之，RES 作为一种潜在的有效化合物，通过 Nrf2 信号通路抑制 ASFV 感染和减轻 ASFV 感染诱导的氧化应激，表现出广泛的疗效。
结果
1. ASFV infection induces oxidative stress
本研究通过重新分析实验室之前的转录组数据，探讨了ASFV感染是否引起氧化应激。与未感染的PAMs相比，ASFV-WT感染的PAMs在基因表达差异分析中显示出与应激信号通路相关的细胞反应和与转录因子及抗氧化活性相关的分子功能的富集。进一步通过DCFH-DA探针测定ASFV-WT感染的PAMs在12、24和48小时后的ROS水平，结果显示感染组的ROS水平显著升高，同时病毒基因组拷贝数和病毒滴度也增加。综上所述，研究表明ASFV感染能够引起氧化应激反应。
2. ASFV infection suppresses the Nrf2 signaling pathway
进一步探讨了ASFV感染是否抑制Nrf2信号通路，这是细胞应对氧化应激的主要防御机制。通过重新分析转录组数据，发现ASFV-WT感染抑制了Nrf2信号通路中的关键基因，如GCLM、GCLC、Keap1和NFE2L2（Nrf2）。为了验证ASFV感染是否在体内外抑制Nrf2通路，研究人员检测了ASFV-WT感染的PAMs中Nrf2及其下游基因的转录水平，结果显示，ASFV-WT感染的PAMs在12、24和48小时后，Nrf2、γ-GCS、SLC7A11和GSR基因的mRNA水平均显著下调。此外，通过对之前感染ASFV-WT的猪组织进行RT-qPCR检测，也发现Nrf2及其下游基因的转录水平在感染组猪中降低。综上所述，这些数据表明ASFV感染会抑制Nrf2信号通路。
3.Nrf2 inhibits the replication of ASFV in WSL cells
探讨了Nrf2是否抑制ASFV的复制，实验中，使用转染效率较高的WSL细胞，将不同量的pMyc-Nrf2质粒转染入细胞，转染24小时后，以MOI 1感染ASFV-WT，并在感染24小时后进行Western blot、qPCR和HAD检测。结果显示，Nrf2的过表达显著降低了ASFV A137R的表达（图3A）、病毒基因组拷贝数（图3B）和病毒滴度（图3C），表明Nrf2显著抑制了ASFV在WSL细胞中的复制。
4. Screening of Nrf2 activators against ASFV
研究人员开发了一种基于表型筛选的高通量筛选平台，旨在筛选能够激活Nrf2的化合物以抗击ASFV。首先，研究人员构建了荧光报告病毒rASFV-mRuby，并通过荧光观察和PCR确认其纯化。接着，使用rASFV-mRuby建立了高通量筛选平台，并确定了适用于筛选的实验条件。在128种小分子化合物中，7种显示出显著的ASFV抑制作用，其中RES是唯一能够激活Nrf2的化合物。进一步实验表明，RES能够激活Nrf2信号通路，并有效抑制ASFV的复制，IC50值为1.18 μM，具有较高的选择性指数（121.27），显示出RES作为潜力巨大的抗ASFV化合物的前景。此外，RES对ASFV的抑制作用在不同时间点持续有效，并且对不同基因缺失的ASFV菌株也具有抗病毒活性。这些结果表明RES具有显著的抗ASFV活性，并能激活Nrf2信号通路。
5.Glutathione serves as the major differential metabolite of RES inhibiting ASFV replication in untargeted metabolomic analysis
随后探讨了RES通过Nrf2抑制ASFV复制的机制。通过代谢组学分析，PAMs分别在未感染、感染ASFV-WT（MOI=1.5）和ASFV-WT与40 μM RES共同处理的条件下进行分析。结果表明，OPLS-DA分析显示所有实验组之间有明显的分离，表明ASFV感染或RES与ASFV联合处理改变了细胞代谢。维恩图分析揭示了两组比较中共有或独特的显著差异代谢物，其中共有的差异代谢物中，谷胱甘肽是唯一的共同代谢物。具体而言，ASFV感染过程中谷胱甘肽显著上调，而在RES与ASFV共同处理的PAMs中，谷胱甘肽水平较感染组下调。这些结果表明，谷胱甘肽是RES抑制ASFV复制的主要差异代谢物。
6.RES inhibits ASFV replication through the Nrf2-mediated GSH production
同时探讨了谷胱甘肽（GSH）作为抗氧化剂在ASFV复制中的作用。首先，通过CTG实验评估了GSH对PAMs的安全浓度，结果表明在8 µM浓度下GSH对PAMs没有细胞毒性。随后，研究人员用不同浓度的GSH（1、2、4和8 μM）处理PAMs并感染ASFV-WT，结果表明GSH以剂量依赖的方式抑制ASFV复制。为了进一步评估抑制GSH合成对ASFV复制的影响，使用GSH合成抑制剂BSO处理PAMs，发现当BSO浓度≤5 μM时没有细胞毒性。BSO处理后，PAMs中的GSH水平显著下降。接着，BSO处理的PAMs在感染ASFV-WT后，病毒基因组拷贝数和病毒滴度明显增加，表明抑制GSH合成促进了ASFV复制，进一步证明了GSH在抑制ASFV复制中的作用。
7.RES reduces the ROS level induced by ASFV infection depending on the Nrf2-mediated GSH production
最后探讨了RES通过谷胱甘肽（GSH）减少ROS水平的机制。在ASFV-WT感染的PAMs中，RES显著降低了细胞内的ROS水平，并在12、24和48小时后增加了细胞内的GSH水平。此外，RT-qPCR分析结果显示，与ASFV-WT感染组相比，RES显著提高了Nrf2及其靶基因（包括γ-GCS、SLC7A11和GSR）的mRNA水平，表明RES通过激活Nrf2信号通路促进GSH的生成，从而发挥抗氧化作用。这些结果表明，RES通过激活Nrf2信号通路，增强GSH的产生，进而减轻ASFV感染过程中的氧化应激反应。
总结与展望
本文讨论了ASFV感染抑制Nrf2信号通路，导致氧化应激，从而可能加剧疾病进程。研究发现，RES作为Nrf2的激活剂，通过激活Nrf2-GSH信号轴，发挥抗ASFV和抗氧化活性。RES通过促进GSH的生成，抑制ASFV复制，并且这种作用依赖于Nrf2信号通路。此外，RES的抗病毒作用不仅仅依赖于GSH，还可能涉及其他机制，如通过激活sirtuin蛋白抑制中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）的复制。尽管在BSO抑制GSH合成的情况下，RES的抗ASFV活性未完全丧失，但GSH仍然是RES抗病毒作用的关键因素。总的来说，这些发现为ASF的预防和控制提供了新的见解和策略，尤其是在缓解病毒感染引发的氧化应激方面具有重要意义。
来源：CaoLab
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