慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA检测的临床意义

1 北京大学医学部；

2 中国医科大学附属盛京医院；

3 复旦大学附属华山医院；

4 解放军三〇二医院

慢性乙型肝炎（CHB）及其所导致的肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌仍是严重威胁我国人群健康的重大疾病。共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在导致HBV感染慢性化，也是CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因。因此，肝组织内检测不到cccDNA被认为是判断HBV感染彻底治愈的一项重要指标。然而，临床上以cccDNA检测为目的的肝穿刺活组织检查难以普遍开展，除了有创性以外，cccDNA在肝脏中的分布不均、松弛环状DNA（rcDNA）对cccDNA检测特异性的影响以及目前尚无经严格验证和审批上市的cccDNA检测试剂盒限制了其应用。因此，在无法直接精确检测肝组织内cccDNA及其活性的情况下，探索能够反映肝内cccDNA活性的替代检测指标，并用来监测肝内cccDNA水平和转录活性具有十分重要的意义。血清标志物易于获得、可重复取样，是临床上最便于采集和动态观察的检测样本。

对HBV感染复制过程的再认识，有助于筛选能够反映cccDNA活性的病毒学指标

在HBV复制过程中，转录自cccDNA的3.5 kb前基因组RNA（pgRNA）与具有逆转录活性的HBV DNA聚合酶（p蛋白）结合形成复合物，招募HBcAg聚集形成核衣壳。在核衣壳内，首先以pgRNA为模板，p蛋白发挥逆转录酶活性合成病毒的负链DNA，再以负链为模板合成出不完整的正链DNA；而pgRNA则被p蛋白的RNase H酶活性所降解。最终含有不完全开链环状rcDNA的核衣壳经多囊泡小体释放形成完整的子代病毒。然而，1996年德国学者在探究HBV能否成功感染人外周血单个核细胞时意外地发现，患者血清中还存在HBV RNA。

近年来，我国和国外学者相继发现这些HBV RNA实质上可能就是核衣壳内未经逆转录的pgRNA。与已经完成rcDNA合成的成熟核衣壳一样，这些含有未经逆转录pgRNA的核衣壳也可获得病毒外膜，并以病毒样颗粒形式释放。包含有rcDNA或pgRNA的核衣壳在取得病毒外膜后形成实心病毒颗粒。但最新研究提示患者血清中也存在大量核衣壳内不含任何病毒核酸的空心病毒样颗粒（图1）。HBV RNA病毒样颗粒也带有由HBsAg组成的病毒外膜，因此理论上讲HBV RNA病毒样颗粒可以像丁型肝炎病毒那样具有感染性。但笔者最近在抗病毒治疗阻断高病毒载量孕妇母婴传播的队列研究中发现，在核苷和核苷酸类药物（NAs）的作用下，这些HBV RNA病毒样颗粒往往不具有感染性。

图1 HBV感染复制周期示意图

图1显示3.5 kb preC/pgRNA转录体只能来自cccDNA。其中preC RNA编码HBeAg，pgRNA则既是子代病毒rcDNA逆转录合成的模板，也是HBcAg和病毒p蛋白的信使RNA。HBeAg和HBcAg均来自cccDNA，能够在一定程度上反映cccDNA的存在和转录活性。由于二者氨基酸序列有较多的重叠难以区分，有学者研制了能够同时定量检测血清HBeAg和HBcAg的核心抗原相关抗原(HBcrAg)试剂，目前这一新的病毒学指标的临床意义正逐步获得重视。

血清HBV DNA及HBsAg检测用于评价NAs治疗均有一定的局限性

既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg水平均与肝组织内cccDNA的活性呈正相关，其中血清HBV DNA是被广泛用于判断患者病毒学应答、疗效观察及巩固治疗后停药的重要标识。持续病毒学应答的定义为：停药后HBV DNA 持续低于高敏检测试剂的检测下限。然而，在NAs抗病毒治疗的情况下，血清HBV DNA消失可能并不代表肝组织内cccDNA被清除或处于转录沉默状态。这也解释了即使按现行指南在巩固治疗后才停药，仍有非常高的病毒学反弹和疾病复发率。

同样，血清HBsAg水平是被广泛用作判定CHB抗病毒治疗应答的重要指标。血清学HBsAg消失更被广泛认为是理想的临床抗病毒治疗终点，并将HBsAg消失（伴有或不伴有血清学转换）定义为“功能性治愈”，国内称之为“临床治愈”。但是，由于HBsAg既可来源于cccDNA，也可来源于整合的HBV DNA片段，故即使经长时间NAs抗病毒治疗能够使肝组织内cccDNA几近耗竭或转录活性几近沉默，血清HBsAg仍然可能持续阳性。因此，将血清HBsAg持续消失作为功能性治愈或临床治愈的判定标准，可能会使一些患者继续接受不必要的抗病毒治疗。因此，临床上亟需能够更好地反映cccDNA存在和转录活性的替代指标。

血清HBV RNA水平能够较好地反映肝组织内cccDNA的活性

近期的一些动物实验和临床队列研究结果均表明，在HBeAg阳性的慢性HBV感染者中，血清HBV RNA与肝组织内cccDNA水平呈正相关，而这种相关性在HBeAg阴性慢性HBV感染者中往往消失。笔者研究显示，在未经治疗的HBeAg阴性慢性HBV感染者中，HBV聚合酶RT区的突变可能是血清HBV RNA水平与肝组织内cccDNA水平相关性消失的原因之一。虽然在经过NAs治疗的慢性乙型肝炎患者中，血清HBV RNA定量不再能够反映肝组织内cccDNA的水平，但却能定性反映肝组织内的cccDNA是否有转录活性。因此，血清HBV RNA有可能被用作预测NAs停药安全性的候选指标。此外，张文宏教授团队近期发表的一项研究还显示，在接受NAs治疗患者中，虽然HBV DNA已经降低至不可测的水平，但这些患者的肝脏组织学仍然有炎症和纤维化的表现；进一步分析发现，血清HBV RNA水平与肝脏炎症程度评分（r=0.665, P＜0.001）及纤维化程度评分（r=0.722，P＜0.001）均明显相关。

血清HBV RNA在CHB抗病毒治疗进阶式“治愈”各阶段的应用展望

如果按现行指南建议在巩固治疗后停药，尽管仍有较高比例的停药后反弹和复发，但约50%的HBeAg阳性患者和30%的HBeAg阴性患者，在停药满3年时仍能维持病毒学应答。鉴于血清HBV RNA能够较好地反映肝组织cccDNA的活性，如果在停药前通过检测血清中的HBV RNA水平对患者的复发风险进行预判，将有助于甄别出那些已经达到病毒学应答并且在停药后能够维持病毒学应答的“部分治愈”的患者，从而实现安全停药。另外，越来越多的临床治疗研究显示，处于HBsAg低值阳性这一“准临床治愈” 阶段的患者，在接受了有限疗程的长效干扰素等治疗后发生血清HBsAg阴转的比例较高。据此，对长期接受NAs治疗但血清HBsAg仍然低值阳性的患者，笔者提出了基于血清HBV RNA检测是否阳性，分别采取换用或加用长效干扰素治疗、以追求更高“临床治愈”率的精准治疗路径的建议。

CHB的治愈存在3个需要克服的障碍：病毒在体内持续存在、肝脏病理学异常（肝脏炎症坏死、纤维化等）和机体抗HBV的免疫反应紊乱。王福生等提出了“爬坡”理论，即在抗病毒治疗基础上联合有效的免疫调节治疗，帮助患者恢复抗病毒免疫应答，以最终达到持久清除病毒、恢复机体保护性免疫的目的。“完全治愈”指通过治疗“使体内没有任何病毒残留、机体恢复到与从未感染人群一样的状态和预期寿命”。目前多数学者认为，这一终极的“完全治愈”既几乎不可能达到，也无法通过实验室手段鉴别是否达到。为此，笔者提出了从“部分治愈”、“准临床治愈”、再到“临床治愈”（或“功能性治愈”）的阶梯性提升模式（图2）。笔者希望，以cccDNA消失或静默为基础、以HBV DNA和HBV RNA持续阴性为依据的“部分治愈”能够预测NAs停药后复发或病毒学反弹风险；在此基础上的以血清HBsAg低水平为标准的“准临床治愈”，能为更多的CHB患者带来战胜乙型肝炎的希望。最后，需要特别强调的是，血清HBV RNA检测的临床意义仍需要大规模的临床研究进行验证，更需要在未来可能的真实世界的应用中不断完善。

图2 NAs巩固治疗后，基于HBV RNA检测的慢性乙型肝炎抗病毒治疗阶梯式“治愈”建议

关于重新定义“病毒学应答”概念的建议和基于HBV RNA检测的停药风险预测建议

在NAs的抗病毒作用下，血清HBV DNA的消失仅能代表病毒的逆转录过程被有效抑制，并不能真实反映肝细胞内cccDNA的转录活性状态。而HBV RNA病毒样颗粒的发现让笔者意识到，在NAs阻断逆转录过程后，存在于核衣壳内的pgRNA不再能有效地转换成rcDNA，转而以HBV RNA病毒样颗粒的方式释放进入血液循环。由于整合的HBV基因组最长也不会超过双链线性DNA的全长（~3.2 kb），故3.5 kb长的pgRNA只能由cccDNA直接转录产生。相比血清HBsAg水平，血清HBV RNA能够更好地反映肝组织cccDNA的活性。我国几个团队通过合作研究发现，接受NAs治疗的CHB患者停药时血清HBV RNA水平与停药后病毒学反弹发生率密切相关，即停药时血清未检出HBV RNA的患者发生反弹的风险显著降低。

据此，笔者提出了“安全停药”的建议，即对巩固治疗后达到现指南停药标准的患者加测血清HBV RNA，对那些持续阴性的患者可以考虑尝试停药。笔者倡议，对于这一依据小样本回顾性研究发现的新指标，应进一步开展多中心、前瞻性、大样本队列研究，以验证其预测停药后病毒学复发及临床复发的能力。