【摘要】WT1（Wilm's tumor gene）基因在白血病及各种实体肿瘤包括肺癌和乳腺癌中高表达，且在这些恶性肿瘤中起癌基因作用，提示了WT1 蛋白可以作为一个新的超表达的肿瘤抗原。WT1 九聚肽体外树突状细胞诱导细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）产生WT1肽特异性CTL，这种CTL可以杀伤内源性表达WT1的白血病和实体瘤细胞。I 期临床试验结果提供了WT1肽可能作为免疫制剂而用于临床的依据。
【关键词】基因；肾母细胞瘤；白血病；免疫疗法
白血病患者行异基因骨髓移植（all0-BMT）后的移植物抗白血病（graft-versus-leukemia,GVL）效应为肿瘤免疫效应提供了令人信服的依据，证明了免疫治疗肿瘤的合理性。寻找广泛表达的肿瘤抗原作为HLA-1 类抗原限制的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的作用靶点，对发展T细胞介导的肿瘤免疫治疗显得尤为重要。
近年来，随着抗原提呈细胞（APC）和效应细胞相互作用的分子机制和生物信息学的研究进展，研究人员鉴定了许多可能用于免疫治疗的候选抗原。研究发现WT1基因参与人类的造血调控，在多种白血病及实体瘤中WT1基因异常高表达。本研究就WT1基因的结构功能特点及其在恶性肿瘤靶向免疫治疗中的作用作综述。
1、WT1 的结构和功能
WT1（Wilm's tumor gene）基因定位于11p13，是最早发现与Wilm's肿瘤发生、发展有关的基因，全长约50kb，有10个外显子，转录产物长约3kb，编码一个相对分子质量约（52~54）X10^3的，具有激活和抑制双重功能的转录调控蛋白。该蛋白由两个功能结构域组成：C端有Cys2-His2的锌指结构，为序列特异性的DNA结合区；N端富含谷氨酸及脯氨酸，为转录调控区域。
WT1蛋白能与许多生长调控因子基因及其其受体结合 [ 如胰岛素样生长因子2（IGF-2)、胰岛素样生长因子1 受体（IGF-1受体）、血小板衍生生长因子A（PDGF-A）、表皮生长因子 （EGF）、转化生长因子β（TGF-β）、维生素D受体、bcl-2和c-myc基因等，以及WT1自身富含“GC”的DNA同源序列（5GCGGGGGCG-3）]，从而影响这些靶基因的启动子活性，调节这些细胞生长因子 的转录。WT1对转录起激活还是抑制作用，取决于细胞组织类型、WT1异构体的不同及与其他基因的相互作用。
野生型WT1基因通过不同的RNA选择性剪切形式，共可编码出至少24种不同的拼接异构体，这些蛋白同工异构体各具不同的生物学功能，其中主要两种选择性剪接，编码4种异构体。第一种剪接位于外显子5，编码17个氨基酸插入锌指结-构和调控区，称为WT1+17AA/—17AA；第二种剪接编码3个氨基酸[赖氨酸-苏氨酸-丝氨酸（KTS）]插入外显子9和10，即第3和第4锌指区之间，称为WT1+KTS/-KTS。两种剪接形式使用WT1在连接DNA的特性方面及调控基因转录方面的作用不同。
2、WT1基因在白血病中的表达特点
WT1主要在胚胎发生过程中表达，对泌尿生殖系统的发育起重要作用。在成人，WT1仅在肾小球足细胞层、卵巢的颗粒细胞、子宫内膜、睾丸Sertoli细胞、间皮细胞、乳腺导管和小叶、脾脏及骨髓的早期未成熟的造血细胞中微量表达，因些WT1基因表达具有严格的组织特异性。
1992年Miwa等首先报道了用Northern blot方法证实在44%急性淋巴细胞白血病（ALL）和68%急性髓细胞白血病（ALL）患者中有WT1超表达。
随后许多研究发现几乎所有的白血病原始细胞（无论系别）中持续表达WT1，与其在极少数生理性造血干细胞（CD34+）中短暂表达形成鲜明对比，且在大多数这类原始细胞中，WT1核蛋白可被捡出。
AML各亚型中，M0-3高表达，M4尤其M5低表达，流式细胞仪筛选的CD34-CD33+细胞高表达WT1。在ALL中，CD19+CD20-前B细胞急淋WT1的表达是CD19+CD20-前B中间型急淋的20倍； FAB分型中L2型WT1表达高于L1型，T-ALL表达高于B-ALL。
慢性粒细胞白血病患者随着病情从慢性期进展到急性期，WT1表达水平逐渐增高，与病情进展相平行。骨髓增选异常综合征（meyelodysplastic syndrome,MDS）随着从难治性贫血（RA）经难治性贫血伴原始细胞过多（RAEB）和难治型贫血伴原始细胞过多转变型（RAEB-T）到完全转化成急性白血病（AL），WT1基因表达水平显著上升，与病情进展相平行。
慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、浆细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤中WT1不表达，提示了WT1表达仅限于不成熟的白血病细胞。ALL患者WT1超表达，其表达水平与性别、年龄、FAB分型、乳酸脱氢酶水平、染色体核型及前期MDS等无关，故其可成为一种“泛白血病”标志。
关于WT1表达与白血病预后的关系，实时定量-PCR结果提示，在正常者及纯化CD34+细胞仅表达极微量WT1转录本，甚至在正常外周血（peripheeral blood,PB）检测不到；相反，在所有的急性白血病初诊时，其骨髓（bone marrow,BM）和PB中WT1表达很高。
随访WT1表达与其他用来监测微小残留病灶（minimal residual disase,MRD）分子标志（融合基因产物、流式细胞仪检测）的意义相同。且在AL随访中，WT1再次增高往往预示着复发；精确定量外周血干细胞（PBSCs）中WT1表达水平，可以评估AML患者自体造血干细胞移植（APBSCT）后的复发。因此认为WT1可作为泛白血病标志基因来监测MRD，提示WT1可作为白血病治疗的靶点。
3、WT1基因在实体瘤中的表达特点
研究发现WT1基因在多种实体瘤包括乳腺癌、结肠癌及肺癌组织中均超表达，WT1蛋白可以作为恶性肿瘤抗原。
Oji等采用RT-PCR检测了34株实体瘤细胞系中WT1的表达水平，结果发现胃癌（3/4）、结肠癌（5/5）、肺癌（12/15）、乳腺癌（2/4）及卵巢癌（2/2）、胚胎细胞肿瘤（1/1）、子宫癌（1/1）、甲状腺癌（1/1）和肝癌细胞（1/1）系均表达WT1，也即82%（28/34）实体瘤细胞系表达WT1。
采用PCR-SSCP法进一步对其中3株表达WT1的细胞系（胃癌AZ-521、肺癌OS3及卵巢癌TYK-nu）分析WT1基因突变与后缺失情况，结果未发现任何突变，而且该3株细胞系经WT1反义寡核苷酸技术处理后，WT1蛋白表达水平均下降，细胞生长受抑制；进一步将WT1基因持续强行表达于上述癌细胞中，能够抑制反义寡核苷酸对癌细胞生长的抑制效应。这些结果提示了WT1基因在实体瘤生长过程中起重要作用，而且是起了癌基因作用而不是抑癌基因作用。
Menssen等用RT-PCR法检测，结果发现胶质母细胞瘤（5/8）、肺癌（5/11）、结肠癌（5/15）细胞株中存在WT1表达，而HT29结肠癌细胞株在诱导分化后WT1表达缺失。
Loeb等研究发现WT1蛋白在原发性乳腺癌中高表达，而在正常乳腺上皮组织中表达不高，而且原发性乳腺癌（6/19）组织中WT1启动子甲基化，正常乳腺上皮组织中不存在WT1启动子甲基化。
Miyoshi等采用实时定量PCR技术检测了99例乳腺癌组织中WT1 mRNA表达水平，结果发现WT1 mRNA表达水平与临床病理参数（如：绝经状态、肿瘤大小、淋巴结状态、组织学分类及雌激素受体状态）无关，WT1 mRNA高表达者5年无病生存率为62.5%，明显低于WT1低表达者（77.2%）；多变量分析显示WT1为独立于其他传统因素的重要的乳腺癌预后因素，因而认为检测肿瘤组织中WT1表达水平为乳腺癌患者的极用价值的预后因素。
Zapata-Benavides等研究发现WT1高表达与乳腺癌患者预后差相关，WT1表达水平与乳腺癌细胞增殖成正相关。采用脂质体包裹WT1反义脱氧寡核苷酸技术下调WT1表达能抑制乳腺癌细胞生长，降低细胞周期蛋白D1的水平，这些结果提示WT1蛋白通过促进乳腺癌细胞增殖导致乳腺癌进展。
Oji等采用实时定量-PCR技术及免疫组化技术检测发现，所有食管鳞状细胞癌患者组织中均超表达WT1；并且在20例食管鳞状细胞典型增生组织中可以检测到WT1蛋白；RT-PCR结果显示83%（10/12）肠癌细胞系中高度表达WT1 mRNA，而采用实时定量-PCR检测结果提示87%（13/15）原发结肠肿瘤中WT1 mRNA超表达，仅 2 例原发肿瘤低表达WT1 mRNA，而所有样本的正常结肠黏膜组织中均检测到WT1 mRNA低表达。对PCR产物进行测序分析显示，+KTS和-KTS两种异构体均可被检测出，但未发现锌指结构突变，提示为野生型WT1表达。
4、WT1基因靶向免疫治疗恶性肿瘤的实验研究
由于WT1基因在白血病及各种实体瘤包括肺癌和乳腺癌中高表达，且在这些恶性肿瘤中起癌基因作用，提示了WT1蛋白可以作为一个新的超表达的肿瘤抗原。许多学者从事靶向WT1免疫治疗白血病和实体瘤在体内及体外的实验研究。
理论上，多种肽疫苗（野生型WT1蛋白序列）、肽链负载树突状细胞（DC）、输注WT1特异性CTL和WT1 DNA疫苗均能用于产生细胞介导的针对WT1的特异免疫，WT1基因可作为CTL介导的白血病细胞体外纯化的理想靶点和白血病及其他表达WT1的恶性肿瘤体内抗原的特异性治疗靶点。
4.1 WT1肽特异性细胞毒T淋巴细胞清除肿瘤细胞
Oka等第一次将超表达的肿瘤抗原WT1作为MHC I类抗原限制性CTLs作用的靶分子，用于T细胞介导的白血病免疫治疗。
他们选择并合成了4种源于WT1蛋白并含有HLA-A2.1分子结合锚位的九聚肽链，Db126肽段（RM-FPNAPYL residues 126-134）、WH187肽段（SLGEQQYSV residues 187-195）、Db235肽段(CMTWNQMNL residues 235-243）和WH242肽段（NLGATLKGV residues 242-250），其中两种肽段Db126和WH187被证实在体外能与HLA-A2.1分子结合，诱导产生WT1肽特异性CTLs。
这两种肽刺激的T2细胞在体外反复致敏健康HLA-A2.1+供者外周血单个核细胞，产生的CD8+细胞毒T淋巴细胞能特异性地以HLA-A2.1限制方式溶解WT1肽刺激的T2细胞。该CTLs同时能特异地溶解WT1+/HLA-A2.1+白血病细胞，但不能溶解WT1+/HLA-A2.1+白血病细胞及WT1+/HLA-A2.1+B淋巴样细胞。
Gao等也证实两种针对WT1肽段的CTL细胞株均能以HLA-A2.1限制性的方式选择性杀伤表达WT1的白血病细胞，并抑制HLA-A2.1+白血病转化的CD34+祖细胞的克隆形成，但正常CD34+干祖细胞的功能不受影响。
2000年Ohminami等用WT1来源的肽段负载树突状细胞，再反复致敏CD8+T细胞，建立了一个HLA-A24限制性特异针对WT1来源多肽（CMTWNQMNL residues 235-243）的抗白血病CTL细胞株TAK-1。
2002年Azuma等又建立了WT1来源多肽（RQPSCQKKF residues 417-425）特异性的CD8+CTL细胞株NIM-1。它们均能溶解HLA-A24+并表达WT1的白血病细胞，但不能溶解HLA-A24-白血病细胞或正常细胞。
以上结果提示WT1肽链特异性CTL忽略了表达生理水平WT1的正常细胞。同时TAK-1及NIM-1对白血病细胞的细胞毒性不协同，提示通过CTLs识别单一的肿瘤特异性抗原决定簇，就足以对肿瘤细胞发挥最大的细胞毒作用。
由此，说明WT1是CTL介导的体外白血病祖细胞清除和表达WT1白血病的抗原特异性治疗的理想靶位，从而为发展以WT1为靶分子的选择性T细胞治疗和针对白血病和实体瘤的WT1疫苗奠定了基础。
Tsuboi等将天然WT1v9肽段CMTQNQMNL第2位的M用Y替换，这种修改过的肽段与HLA-A*2402的亲和力更强，免疫性更高，能更有效地诱导出WT1特异性的CTL，后者识别并杀伤天然WT1肽段冲击致敏的CIR-A*2402细胞及内源性表达WT1的原代白血病细胞。
TAK-1能够抑制HLA-A24+肺癌细胞株，而对HLA-A24-无细胞毒作用；向移植HLA-A24+肺癌细胞株的裸鼠输注TAK-1细胞，可抑制癌细胞生长并延长生存期[21]。这一研究结果证实了WT1基因可以作为泛肿瘤相关抗原，且WT1靶向免疫治疗为白血病和肺癌患者提供了一种治疗选择。
4.2 WT1疫苗治疗恶性肿瘤
免疫接种的根本目的是增加直接针对疫苗中抗原的抗原特异性T细胞和B细胞的数目。每一次免疫接种使抗原特异性T细胞数量增加，然而，最终抗原特异性T细胞数目将到达平台期；体内T细胞和B细胞的免疫记忆可因核苷酸疫苗编码蛋白的持续表达而不断增强，从而实际长久免疫。因此抗原特异性疫苗具有一定局限性。而治疗性WT1疫苗应用于微小残留白血病患者可以产生足够数目的免疫T细胞，阻止疾病复发和进展，未尽需要体外T细胞扩增和输注。
Tsuboi等将能编码全长WT1蛋白的质粒DNA行肌肉注射入C57BL/6G小鼠，被接种的小鼠能产生针对于WT1蛋白的CTLs，后者能以MHC-I限制性的方式杀伤表达WT1的白血病细胞，而且这种接种过的WT1疫苗的小鼠能排斥皮下接种表达WT1抗原的肿瘤细胞，表明用WT1质粒DNA预防接种能诱导出WT1抗原特异性的CTLs，并使接种小鼠获得对WT1抗原表达的肿瘤细胞的排斥活性。
Gaiger等分析了63例AML和81例CML患者血清中全长蛋白或剪接的WT1抗体，结果25%AML和19%CML患者血清中可检测到对WT1蛋白的N端反应。
Wu等研究发现白血病和MDS患者中针对WT1蛋白的IgM和IgG抗体检出率及滴度均高于健康对照志愿者。进一步研究IgG介导对WT1的体液免疫反应，结果发现白血病和MDS患者中Th1型WT1抗体如IgG1、IgG2和IgG3检出率及抗体滴度明显高于健康志愿者，而Th2型WT1抗体如IgG4无明显增加，提示了白血病和MDS患者体内产生针对WT1蛋白的是Th1型体液免疫反应。这一结果提示针对WT1蛋白的Th1型细胞免疫反应是WT1靶向免疫治疗肿瘤的重要方式。
Nakajima等首次采用WT1多肽联合牛分枝杆菌卡介功细胞壁骨架（BCG-CWS）接种能更有效清除WT1表达的肿瘤细胞，提示BCG-CWS具有增强天然免疫能力，联合WT1肽接种能够增强WT1特异性免疫反应（获得性免疫）。
4.3 WT1肽特异性CTL免疫治疗肿瘤的I期临床试验结果
Oka等首先进行了以WT1肽为基础的肿瘤免疫治疗临床试验。在I期临床试验中将MDS或MDS伴骨髓纤维化转化的患者确定为白血病患者，皮内注射HLA-A*2402限制的WT1九聚肽（Montanide ISA51辅剂乳化）；单剂量WT1接种后即能增加WT1特异性CTLs，并使白血病原始细胞快速下降。
随后该研究小组又详细报道了WT1肽为基础的免疫治疗乳腺癌、肺癌、MDS、急性白血病 I 期临床试验结果。总共有26例患者接受了WT1肽注射（至少1次以上），其中18例患者注射WT1肽≥3次。毒性反应主要是注射部位出现局部红肿；乳腺癌、肺癌或AL造血正常，而MDS患者由于表达WT1基因的转化型造血干细胞产生异常造血导致白血病细胞下降、肿瘤缩小或肿瘤标志物减少；注射WT1疫苗后WT1特异性CTLs增产率与临床反应呈正相关。
因此WT1疫苗能产生WT1特异性CTLs，使肿瘤缓解，而对正常组织无影响，为以WT1肽为基础的免疫治疗成为白血病或MDS患者的治疗方法提供一线临床资料。
Mailander等报道了1例复发白血病患者采用WT1肽免疫接种治疗后获再次完全缓解，且体内实验研究未发现肾毒性及明显的血液学副反应。
Tsuboi等对2例进展期肺癌患者行皮内注射0.3mg HLA-A*2402限制的WT1九聚肽，每2周接种1次WT1疫苗可使肿瘤标志物如CEA和Sialy Lweisj（x）（SLX）下降，同时产生一过性肿瘤组织缩小，除了注射部位局部红斑并无其他副反应出现。
5、结束语与展望
WT1基因在白血病和多种实体瘤（包括肺癌和乳腺癌）中表达，且在这些恶性肿瘤中起癌基因作用，提示了WT1蛋白可以作为一个新的超表达的肿瘤抗原。HLA-A*2402（或HLA-A0201）限制的WT1 9聚肽体外刺激外周血单个核细胞可以产生WT1肽特异性CTL，这种CTL可以杀伤内源性表达WT1的白血病和实体瘤细胞。
造血系统疾病如AML、CML和MDS患者体内可以检测出抗WT1的IgM和IgG抗体，提示了WT1蛋白在白血病中超表达具有真正的免疫原性。I 期临床试验结果提示了以WT1肽作为基础的免疫治疗用于白血病及实体瘤患者具有较好的临床作用。
然而，目前以WT1肽介导的肿瘤免疫治疗其局限是只能用于具备特定HLA-A表型的白血病患者。由于WT1在正常CD34+造血干细胞及其他组织干细胞中低表达，抗原在正常组织中表达有可能刺激免疫耐受而钝化T细胞反应，克服WT1免疫耐受的许多研究正在进行中。
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